目的 评价受体相互作用蛋白激酶3-混合谱系激酶结构域样蛋白(receptor interacting protein kinase 3- mixed-lineage kinase domain-like, RIPK3-MLKL)通路激活介导的坏死性凋亡在小鼠脓毒症相关性肺损伤中的作用,坏死性磺酰胺治疗是否通过抑制MLKL激活缓解肺损伤。
方法 本研究采用两阶段实验设计,第一阶段采用盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture, CLP)复制小鼠脓毒症模型并观察不同时间点的肺损伤程度及坏死性凋亡信号通路激活情况。即采用单臂实验设计,取24只6-8周雄性C57BL/6J小鼠行CLP,分别于术后0h、6h、12h和24h对小鼠进行取样,每个时间点n=6,观察小鼠肺部组织病理学、肺水肿情况、动脉血气分析及坏死性凋亡相关蛋白(RIPK3,MLKL)表达情况,通过第一阶段实验明确RIPK3-MLKL通路激活导致的坏死性凋亡是否参与了脓毒症肺损伤。第二阶段实验,验证MLKL的特异性抑制剂坏死性磺胺(Necrosulfonamide, NSA)是否可阻断脓毒症小鼠坏死性凋亡,逆转肺损伤。采用随机对照干预性实验研究设计,即另选24只小鼠采用随机数字表法分为4组:假手术组(Sham组,n=6)、NSA+假手术组(NSA组,n=6)、CLP手术组(CLP组,n=6)和NSA+CLP手术组(NSA+CLP组,n=6)。在造模后24h观察肺部组织病理学、肺水肿情况、动脉血气分析及坏死性凋亡相关蛋白表达情况。
结果 第一阶段实验发现CLP术后脓毒症相关性肺损伤程度随着时间延长逐渐加重,CLP后24h肺湿/干重比(wet to dry ratio, W/D)上升(6.05±0.70 vs 4.33±0.22, P0.01),动脉血氧分压降低(72.05±2.47 vs 88.65±2.31, P0.01),二氧化碳分压升高(50.02±2.70 vs 40.53±2.59, P0.01)。坏死性凋亡相关蛋白p-RIPK3及p-MLKL表达明显升高(P0.01)。第二阶段实验中应用NSA后,与CLP组相比,NSA+CLP组W/D值下降(4.73±0.24 vs 6.07±1.10, P0.01),肺水肿程度减轻,p-RIPK3及p-MLKL表达明显下调(P0.01),动脉血气氧分压升高(79.83±2.59 vs 71.93±3.50, P0.01),但二氧化碳分压差异无统计学意义(46.70±2.67 vs 41.80±2.49, P=0.18)。
结论 RIPK3-MLKL通路激活引起的坏死性凋亡参与了小鼠脓毒症相关肺损伤的过程,NSA通过抑制MLKL激活,抑制坏死性凋亡,缓解小鼠脓毒症相关性肺损伤。